Absztrakt - Irina Gotova - PDF ingyenes letöltés
BULGÁR TUDOMÁNYOK Akadémiája Mikrobiológiai Intézet Stefan Angelov Irina Marinova kész immunregulációs FELTÁRÁSI TULAJDONSÁGOK Tejsavbaktériumok törzsek egészségügyi előnyökkel járó termékekhez Szerzői nyár oktatási és tudományos fokozat odaítéléséért Orvosi kód: 010 612 Oktató: Chl.- homer . Hristo Naidenski, Ph.D. Prof. Dr. Zhechko Dimitrov SOFIA 2019
A dolgozat 170 oldalt tartalmaz, amelyek 42 ábrát és 25 táblázatot tartalmaznak. 331 irodalmi forrást használtak fel, ebből 9 bolgár szerző volt. Szerző: Irina Marinova Gotova A disszertáció megvitatása és célja a kibővített tanterv - D 2 - megvédése
Az alkalmazott rövidítések listája GIT gyomor-bél traktus ICD tejsavbaktériumok CFU kolóniaképző egység FAO Élelmezési és Mezőgazdasági Szervezet WHO Egészségügyi Világszervezet Az GRSA általánosságban biztonságosnak tekintett minőségi minőségbiztonsági vélelmet az EFSA vezetett be, hasonlóan a mikroorganizmusok biztonságának értékelésére szolgáló GRAS rendszerhez élelmiszer és takarmány PCR polimeráz láncreakció ROS reaktív oxigén faj AK aminosav ECM extracelluláris mátrix IC immunrendszer CP krioprotektáns HS tápközeg APC antigént bemutató sejtek BP - Bioaktív peptidek ACE-szulfid Angiotenzin dismutáz IL- Interleukin IBD - Gyulladásos bélbetegség TNF-α Tumor Alfa faktor TGF-β transzformáló növekedési faktor béta IFN - interferon TRFLP terminális restrikciós fragmens hossza polimorfizmus ELISA Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok 3
CÉL ÉS FELADATOK Cél: Az ICD adhéziós és immunszabályozó tulajdonságainak vizsgálata. A törzsek kiválasztása liofilizált probiotikumok kifejlesztésére. Feladatok: 1. Az ICD izolátumok faji hovatartozásának és törzsazonosságának azonosítása modern genetikai módszerekkel. 2. A TRFLP módszer adaptálása az alapvető baktériumcsoportok tenyésztés nélküli meghatározásához az emberi bél mikroflórájában. 3. Az ICD adhéziós képességének vizsgálata a probiotikus törzsek kezdeti kiválasztása és a legerősebben tapadó törzsek tapadási tényezőinek jellegének megállapítása céljából. A tapadáshoz kapcsolódó bakteriális gének expressziójának vizsgálata valós idejű PCR technikákkal. 4. A vizsgált izolátumok által kiváltott megfelelő típusú immunválaszhoz (sejt-közvetített, humorális és gyulladásos) kapcsolódó citokinek értékelése. A makroorganizmus immunválaszát befolyásolni képes törzsek kiválasztása. 5. Az ICD-kből felszabaduló bioaktív peptidek izolálása és tisztítása, amelyek jelentősen eltérő citokinek indukálására képesek. 6. Egy kiválasztott probiotikus törzs klinikai vizsgálata. 7. Technológiai terv kidolgozása liofilizált polibakteriális, szinbiotikus készítmények előállítására. 5.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 1. Mikroorganizmusok és sejtvonalak 1.1. Referencia törzsek 1.2. Vizsgálati izolátumok 1.3. Sejtvonalak és lépsejtek 2. Táptalaj és pufferek 2.1. Baktériumtenyésztő táptalaj 2.2. Sejtvonal és splenocita táptalaj 2.3. Pufferek 3. Krioprotektív keverékek 4. Az azonosítás és tipizálás molekuláris módszerei 4.1. Nem szerinti tipizálás - Nem-specifikus PCR 4.2. Típusszintű gépelés 4.3. Törzsszint-tipizálás - impulzus-elektroforézis 4.4. Nem tenyésztési módszer a baktériumok sokféleségének meghatározására komplex mátrixokban - TRFLP 5. Adhézió és a tapadás molekuláris alapjai 5.1. Az ICD törzsek hámsejtvonalakhoz való tapadóképességének értékelése 5.2. A tapadási tényezők jellegének meghatározása 5.3. A felületi fehérje tapadási tényezők meghatározása 5.4. Valós idejű PCR módszerek az emberi nyálkához való bakteriális tapadás szempontjából fontos szerkezeti gének expressziójának meghatározására 6. Sejtvonalak tenyésztése és fenntartása a citokinindukció értékelésére 6.1. Emberi hámsejtvonalak - CaCo-2 és HT-29 6.2. Monocita emberi sejtvonal - THP1
6.3. Splenociták 7. A citokinindukció értékelése 7.1. A TNF-α szignálpeptid indukciójának értékelése 7.2. Az IL-8 szignálpeptid indukciójának értékelése 7.3. Az IL-6 szignálpeptid indukciójának értékelése 7.4. Az IL-10 szignálpeptid indukciójának értékelése 7.5. A TGF-β szignálpeptid indukciójának értékelése 7.6. Az IFN-y szignálpeptid indukciójának értékelése 7.7. Az IL-1 szignálpeptid indukciójának értékelése 7.8. Az IL-4 szignálpeptid indukciójának értékelése 7.9. Különböző citokinek indukciójának értékelése az ICD által kibocsátott bioaktív peptidekkel 7.9.1. Laboratóriumi sajtok elkészítése 7.9.2. A teljes proteolitikus aktivitás meghatározása 7.9.3. Mintakészítés kromatográfiás analízishez 7.9.4. Folyadékkromatográfiai rendszer kezdeti fordított fázisú szétválasztása frakcionáló elosztóval 7.9.5. Folyadékkromatográfiai rendszer szekunder elválasztása frakcionált kollektorral 7.9.6. A citokinindukció értékelése peptidfrakciókkal 8. A klinikai vizsgálatok elvégzésének protokollja 9. Technológiai rész 9.1. Az erjesztési folyamatok elvégzésének feltételei 9.2. Liofilizációs körülmények 7
2. ábra: Izolátumok és referencia törzsek ARDRA a DNS III enzimmel végzett hidrolízise után, ahol: A referencia törzseket betűkkel jelöltük: b- L. bulgaricus, l- L. lactis, c- L. casei, rh- L. rhamnosus, p- L. plantarum, re- L. reuteri, h- L. helveticus, a- L. acidophilus, g- L. gasseri; Az azonosítatlan Lactobacillus izolátumokat számok jelzik: 1- KM053, 2- KM058, 3- KM120, 4- KM144, 5- KM181, 6- DS012, 7- DS040, 8- DS048, 9- DS197, 10- DS200, 11- DS031, 12- In004, 13- In007, 14- In008, 15- In0011, 16- In002a, 17- In002b, 18- In009, 19- In215, 20- In012; M-molekuláris marker 100 bp. Amint az a 2. ábrán látható. A 2. ábrán laktobacillusok, amelyeket a Hae III enzimmel csak egy reakció nem különböztet meg, a L. helveticus, a L. acidophilus, de ide tartoznak a L. crispatus fajok is, amelyeket a fotó nem mutat be. Ez a három faj az Msp I enzim beadása után is megkülönböztethetetlen marad. Ebben az esetben az EcoRI enzimmel korlátozást alkalmazunk, amely csak az L. helveticus specifikus profiljához vezet (0,8 és 0,7 kbp fragmentumok). A L. acidophilus és az L. crispatus faj profil-párja azonban, amelyet PCR-rel meg lehet különböztetni fajspecifikus primerekkel a módszertani részben meghatározott feltételek és primerek mellett, továbbra is megkülönböztethetetlenek. Más ilyen profilpárok, amelyek még 10 kombinációjával sem különböztethetők meg